通过ELISPOT实现T细胞表位的无偏、高通量鉴定

最近的系统性免疫监测研究表明，在人类中，T细胞对抗原表位的识别比基于 minimalist小鼠模型的假设要复杂得多。增加的复杂性归因于人类中HLA基因座数量更多，这些基因座在杂交群体中通常是杂合的，以及每个HLA限制元件可以结合的肽数量众多，其亲和力足以进行抗原呈递。任何特定抗原上的大量潜在表位是由于每个人的HLA等位基因组成独特。在这个个性化的潜在表位空间中，T细胞反应过程中发生的偶然事件决定了哪些表位引起优势T细胞扩展。建立每位人类受试者中实际参与的T细胞谱。包括针对的个性化肽，因此需要对构成潜在表位空间的所有肽进行系统测试。本章所述方法可以轻松确定全面、高通量表位映射的目标。

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使用干扰素-γ酶联免疫斑点检测表征人乳头瘤病毒的新T细胞表位。

为了克服分离和表征对引起局部感染的病原体（如人乳头瘤病毒(HPV)）特异性罕见T细胞的困难，已经开发出一种协议。涉及的步骤包括识别HPV蛋白中包含T细胞表位的区域，基于干扰素-γ (IFN-γ)分泌选择肽特异性T细胞，并培养和表征T细胞克隆（图1）。受试者1是一位通过活检最近被诊断为高级别鳞状上皮内病变的患者，并在采集T细胞的当天进行了环形电切术治疗（1）。使用重叠合成肽进行干扰素-γ酶联免疫斑点（ELISPOT）测定，确定了人乳头瘤病毒16型（HPV 16）E6和E7蛋白中包含T细胞表位的区域（图2）。该测定的数据不仅用于确定包含T细胞表位的区域，还用于估计表位特异性T细胞的数量，并基于干扰素-γ分泌使用商业化的磁珠（CD8 T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec，Auburn CA）分离这些细胞。所选的分泌干扰素-γ的T细胞被稀释并在含有辐照饲养细胞混合物的条件下单独培养，以支持每个孔中单个T细胞的生长。这些T细胞克隆在含有覆盖已鉴定区域的肽和自体爱泼斯坦-巴尔病毒转化的B淋巴母细胞系（LCLs，如Walls和Crawford所述获得）的条件下，使用IFN-γ ELISPOT检测进行筛选，以尽量减少所需的T细胞克隆细胞数量。与通常在ELISPOT检测中使用的每孔1 x 10(5)细胞不同，使用了在1 x 10(5)自体LCLs存在的条件下1,000个T细胞克隆细胞，大大减少了所需的T细胞克隆细胞数量。自体LCLs不仅向T细胞克隆细胞呈递肽抗原，还保持了孔中的高细胞密度，使表位特异性T细胞克隆细胞能够分泌IFN-γ。这确保了IFN-γ ELISPOT检测的成功进行。同样，IFN-γ ELISPOT 检测被用来表征 CD8 T 细胞表位（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）及其 HLA I 类限制元件（B58）的最小和最佳氨基酸序列。IFN-γ ELISPOT 检测还使用了感染了表达 HPV 16 E6 或 E7 蛋白的水痘-带状疱疹病毒的自体 B 细胞系进行检测。结果表明，E6 T 细胞表位是内源性加工的。显示出其他高危 HPV 型别的同源 T 细胞表位的交叉识别。该方法也可用于描述 CD4 T 细胞表位（4）。结果表明，E6 T细胞表位被内源性加工处理。展示了其他高危HPV类型的同源T细胞表位的交叉识别。该方法也可用于描述CD4 T细胞表位(4)。结果表明，E6 T细胞表位被内源性加工处理。展示了其他高危HPV类型的同源T细胞表位的交叉识别。该方法也可用于描述CD4 T细胞表位(4)。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22434036/